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illumina 测序原理介绍

发布时间:2018-11-28

一些常用基本概念的介绍:

  • flowcell 是指Illumina测序时,测序反应发生的位置,1个flowcell含有8条lane
  • lane 每一个flowcell上都有8条泳道,用于测序反应,可以添加试剂,洗脱等等
  • tile 每一次测序荧光扫描的最小单位
  • reads 指测序的结果,1条序列一般称为1条reads
  • bp base pair 碱基对,用于衡量序列长度
  • 双端测序 只一条序列可能比较长如500bp,我们可以两端每端各测150bp
  • junction 上面说的双端测序,中间会留有200bp测不到的东西,我们叫junction
  • adapter 就是测序中需要的一段特定的序列,有类似于引物的功能
  • primer PCR中的引物

下图就是一台illumina最新的X Ten测序仪。

下图就是flowcell,图中黑色的小线条就是lane,每一个lane中整齐排列了无数个tile,只可惜我们肉眼看不到。

 

图片引用:41j.com/blog/2012/04/ne

下面开始正式介绍测序反应

1.建库

  • 由于Illumina测序策略本身的问题,导致其测序长度不可能太长,目前最好的X Ten也就是双端各150bp,所以不可能直接拿整个基因组去测序,所以在测序的时候需要先打断成一定长度的片段,这个根据需要用不同的策略,一般测人的基因组,我们是将其打断成300 ~ 500bp的长度。这个是根据跑胶控制的。
  • 打断以后会出现末端不平整的情况,用酶补平,所以现在的序列是平末端。
  • 完成补平以后,在3'端使用酶加上一个特异的碱基A,加上A之后就可以利用互补配对的原则,加上adapter,这个adpater可以分成两个部分,一个部分是测序的时候需要用的引物序列,另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列进行PCR扩增,使得我们的DNA样品浓度足够上机要求。
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  • 建库的示意图如下图所示,引用自 tucf-genomics.tufts.edu

 

2.桥式PCR

  • 将上述的DNA样品调整到合适的浓度加入到flowcell中,再加入特异的化学试剂,就可以使得序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过化学键十分强健地相连,如下图。图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater,分别对应序列之前加入的两种adpater
  • 引用:i.ytimg.com/vi/t0akxx8D

 

  • 连接以后就正式开始桥式PCR。首先进行第一轮扩增,将序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链,并洗脱。由于最开始的序列是使用化学键连接的,所以不会被洗。
  • 加入缓冲溶液,这时候序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配进行一轮PCR,在PCR的过程中,序列是弯成桥状,所以叫桥式PCR,一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍,如此循环下去,就会得到一个具有完全相同序列的簇,一般叫cluster
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  • 整体流程如下图所示:

引用自:tucf-genomics.tufts.edu

  • 形成这种1个cluster,1个cluster的形态,在整个flowcell中看上去,示意图如下。其中的每1个cluster就算是1群完全相同的序列。

引用自:intechopen.com/source/h

 

3.测序

  • 测序的过程反而简单了不少。就是来一个primer,然后加入特殊处理过的A,T,C,G四种碱基。特殊的地方有两点,一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基,保证每次只能够在序列上添加1个碱基;另一方面是,碱基部分加入了荧光基团,可以激发出不同的颜色。
  • 特殊处理的脱氧核糖核酸,引用自:http://www.oezratty.net/,图中的核糖的羟基应该换成-N2的叠氮基团。

 

  • 在测序过程中,每1轮测序,保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光,并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的,所以理论上,这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致。一个测序扫描图片如下:

 

  • 随后加入试剂,将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH,然后切掉部分荧光基团,使其在下一轮反应中,不再发出荧光。如此往复,就可以测出序列的内容。示意图如下,引用自http://www.gendx.com/

 

  • 那为什么Illumina测序会有长度限制呢?
  • 测序时,经过长时间的PCR,会有不同步的情况。通俗一点讲,比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链,但是经过1轮增加碱基,其中99个都加入了1个碱基,显示了红色,另外1个没有加入碱基,不显示颜色。这时候整体为红色,我们可以顺利得到结果。随后,在第2轮再加入碱基进行合成的时候,就变成了,之前没有加入的加入了1个碱基显示红色,剩下的99个显示绿色,这个时候就会出现杂信号。当测序长度不断延长,这个杂信号会越来越多,最后很有可能出现,50个红,50个绿色,这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成。测序过程中,使用的碱基是特殊处理的,有一个非常大的荧光基团修饰。在使用DNA ploymerase的时候,酶的状态也会受到底物的影响,越来越差。
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  • 【来源:https://zhuanlan.zhihu.com/p/20702684,知乎-孟浩巍