一些常用基本概念的介绍：
- flowcell 是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane
- lane 每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等
- tile 每一次测序荧光扫描的最小单位
- reads 指测序的结果，1条序列一般称为1条reads
- bp base pair 碱基对，用于衡量序列长度
- 双端测序 只一条序列可能比较长如500bp，我们可以两端每端各测150bp
- junction 上面说的双端测序，中间会留有200bp测不到的东西，我们叫junction
- adapter 就是测序中需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能
- primer PCR中的引物
下图就是一台illumina最新的X Ten测序仪。
下图就是flowcell，图中黑色的小线条就是lane，每一个lane中整齐排列了无数个tile，只可惜我们肉眼看不到。
图片引用：http://41j.com/blog/2012/04/nextgen-sequencing-primer/
下面开始正式介绍测序反应
1.建库
- 由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten也就是双端各150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，所以在测序的时候需要先打断成一定长度的片段，这个根据需要用不同的策略，一般测人的基因组，我们是将其打断成300 ~ 500bp的长度。这个是根据跑胶控制的。
- 打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端。
- 完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A，加上A之后就可以利用互补配对的原则，加上adapter，这个adpater可以分成两个部分，一个部分是测序的时候需要用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用的引物序列进行PCR扩增，使得我们的DNA样品浓度足够上机要求。
- 建库的示意图如下图所示，引用自 http://tucf-genomics.tufts.edu/home/faq
2.桥式PCR
- 将上述的DNA样品调整到合适的浓度加入到flowcell中，再加入特异的化学试剂，就可以使得序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过化学键十分强健地相连，如下图。图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater，分别对应序列之前加入的两种adpater
- 引用：https://i.ytimg.com/vi/t0akxx8Dwsk/maxresdefault.jpg
- 连接以后就正式开始桥式PCR。首先进行第一轮扩增，将序列补成双链。加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱。由于最开始的序列是使用化学键连接的，所以不会被洗。
- 加入缓冲溶液，这时候序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配进行一轮PCR，在PCR的过程中，序列是弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍，如此循环下去，就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫cluster
- 整体流程如下图所示：
引用自：http://tucf-genomics.tufts.edu/home/faq
- 形成这种1个cluster，1个cluster的形态，在整个flowcell中看上去，示意图如下。其中的每1个cluster就算是1群完全相同的序列。
引用自：http://www.intechopen.com/source/html/49419/media/image2.png
3.测序
- 测序的过程反而简单了不少。就是来一个primer，然后加入特殊处理过的A，T，C，G四种碱基。特殊的地方有两点，一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，保证每次只能够在序列上添加1个碱基；另一方面是，碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色。
- 特殊处理的脱氧核糖核酸，引用自：http://www.oezratty.net/，图中的核糖的羟基应该换成-N2的叠氮基团。
- 在测序过程中，每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致。一个测序扫描图片如下：
- 随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。如此往复，就可以测出序列的内容。示意图如下，引用自http://www.gendx.com/：
- 那为什么Illumina测序会有长度限制呢？
- 测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。通俗一点讲，比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，就变成了，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，剩下的99个显示绿色，这个时候就会出现杂信号。当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现，50个红，50个绿色，这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成。测序过程中，使用的碱基是特殊处理的，有一个非常大的荧光基团修饰。在使用DNA ploymerase的时候，酶的状态也会受到底物的影响，越来越差。
- 【来源：https://zhuanlan.zhihu.com/p/20702684，知乎-孟浩巍】
